从琼脂糖凝胜中回收DNA片段的原则
l、去除DNA样品中的杂质
琼脂糖是从琼脂中提取出来的，其中吉有较多的酸根和羟基多糖。目前大多数级别的璩脂糖中混有硫酸酯多糖，这种物质能抑制基因克隆中使用的多种工具酶的活性，如DNA限制性内切酶、连接酶、激酶及聚合酶。在回收DNA时应尽量减少这些酶抑制剂的污染。不管用哪种方法，回收DNA片段的溶液，要用2.5mol/L醋酸铵和乙醇沉淀再用7。q.乙醇漂洗数次，这样处理，可以很有被地去除一些有害的有机分子和无机盐沉淀。已筏列为实验操作常规。近年来琼脂糖的质量有较大提高，如低融点琼脂糖，不但融点降低到65℃左右，更重要的是，其中DNA工具酶的抑制物含量很少，所以有些低融点琼脂糖可以直接在其溶液中对DNA进行内切酶消化和DNA片段之间的连接反应。
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2、提高DNA片段的回收率：
DNA的回收率与DNA片段的大小有一定关系，随着DNA分子量的增大，回收率明显下降．大干20kh时，回收率低于20%。这是由于大的DNA片段与DEAE纤维素纸的结合力强，很难洗脱下来。DNA片段的含量与回收率也有较密切关系，量越少回收率越低，若DNA片段量小于500mg时，几乎很难回收。
回收DNA片段应该注意以下事项：
①提高DNA上样量；
②减小DNA同收时的洗脱容积，若容积过大时，可先用正丁醇进行溶液浓缩；
③正确选择同收DNA片殷的方法。DEAE纤维素纸电泳法适用于500bp到5kb大小的DNA片段的回收；电洗脱法适用于回收5kb以上的DNA片段，低融点琼脂糖回收法较前两类方法的回收率低，但操作简单，甚至加一定缓冲液融化后即可直接进行反应。
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发布于 ： 2021-09-15
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